AAV病毒载体在心脏疾病研究中的设计和应用（上）

9月 6, 2024

心脏疾病，如冠心病、心肌病、心律失常和心力衰竭等，严重威胁人类健康，是全球主要致死原因之一。随着基因治疗技术的发展，腺相关病毒（AAV）载体因其显著优势，已成为心脏疾病研究和治疗的关键工具。在应用AAV进行心脏疾病研究时，如何选择血清型、特异性启动子，确定注射方式和剂量以及取样时间，是研究者普遍关心的问题。本文将深入探讨这些问题，提供AAV病毒载体在心脏疾病研究中的设计和应用策略。
靶向心脏的AAV血清型-病毒层面的设计策略
AAV就像一座“货运飞船”，可以将货物（外源基因）运送至不同的靶细胞。血清型就是AAV这座“货运飞船”的系列号，不同系列的货运飞船表面有不同的交会对接装置，可以与不同细胞表面的受体进行精准的“交会对接”。因此，不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞。（图1，表1）

图1 AAV入侵细胞示意图

表1 不同AAV血清型的细胞表面受体不同1

AAV血清型的选择是实现高效基因递送的关键因素。在选择AAV的血清型时一般需要考虑以下四点：
  1. 细胞/组织特异性；
  2. 注射方式和AAV的产量。静脉注射的给药剂量较高，因此需要选择产量更高的血清型，如AAV9、AAV8、AAVrh.10等，而原位注射的给药剂量较低，因此即使AAV的产量较低也可以满足实验需求；
  3. AAV血清型的流行病学特征。不同地区的物种可能感染过不同血清型的AAV，因此体内可能存在不同AAV的中和抗体。中和抗体会影响AAV的靶向递送效率；
  4. 物种差异。同一种血清型对不同物种的感染效率会有差异，如在小动物中，AAV9对心肌细胞的感染效率优于AAV6，而在羊、猪、猴等大动物中，AAV6对心脏的感染效率要高于AAV9。（图2，图3，图4，图5，表2）

现有的研究资料显示，AAV1、AAV6、AAV8和AAV9对心脏有较好的感染效率，其中AAV9是目前公认的在小鼠体内高效特异性靶向心肌的血清型。

图2五种AAV血清型在小鼠体内的心脏基因递送效率比较2。注射方式为左心室前壁注射，病毒注射总量为5×10^10 vg，体积为10μl。Luc的表达由cTnT启动子控制。

图3 五种AAV血清型在小鼠体内的心脏基因递送效率比较3。注射方式为颈静脉注射，病毒注射总量为1×10^11 vg/小鼠。Luc的表达由cTnT启动子控制。

图4 五种AAV血清型以不同剂量注射至小鼠体内的心脏基因递送效率比较3。注射方式为颈静脉注射。EGFP的表达由cTnT启动子控制。

图5 三种AAV血清型在猕猴体内的心脏基因递送效率比较4。注射方式为心内膜注射，病毒注射量为5.4×10^12 vg/kg。EGFP的表达由CBG启动子控制。Endo，心内膜；Epi，心外膜；IVS，室间隔；LVFW，左心室游离壁。比例尺=200微米。

表2 不同物种、注射方式的AAV血清型应用举例

 
控制目的基因的表达水平和特异性-基因层面的设计策略
用AAV递送外源基因至心脏时，AAV可携带的“货物”有启动子、外源基因编码框、标签、增强子、连接元件等（图6），需要根据实验需求选择不同的“货物”组合（图7）。

图6 基因递送载体的各种要素

图7 AAV GOI质粒的常用结构示意图

 

启动子就像基因的“发动机”，决定基因何时表达、以何种强度表达。心脏中的主要细胞类型为心肌细胞（cardiomyocytes, CM），此外还包括成纤维细胞(fibroblasts, FB)，内皮细胞(endothelial cells, EC)，周细胞(pericytes, PC)，免疫细胞( immune），脂肪细胞(adipocytes, Adip)和神经元(neuronal cells, NC)等，要根据需要感染的靶细胞类型来选择不同的启动子。以下是心脏研究中几种常用的启动子（表3，图8）

表3 心脏研究中常用的启动子

图8  cTnT启动子驱动的心肌细胞特异性基因表达3。AcMVLuc（CMV）和AcTnTLuc（cTnT）被包装进AAV6衣壳。通过颈静脉注射至一周龄的小鼠，剂量为1×10^11 vg/只。给药后的第28天检测荧光素酶活性。H，心脏；L，肝脏；T，胸腺；K，肾脏；S，脾脏；Gn，腓肠肌；B，大脑；Ic，肋间肌。

 
此外，还可以增加一些转录后的调控元件以增强外源基因的表达水平或组织特异性，这些调控元件包括：
  • 内含子。真核mRNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。在多数情况下，真核mRNA内含子的存在可以提高基因的表达水平，因为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段，包括转录、RNA编辑、pre-mRNA的加工、mRNA的出核运输、翻译等。在载体容量允许的情况下添加一个内含子，有助于刺激基因的表达。已上市的眼科基因治疗药物Luxturna就添加了一个内含子，以刺激功能性RPE65基因的表达（图9）。

图9 Luxturna药物结构示意图5

  • MicroRNA结合位点。MicroRNA（微小RNA，简称miRNA）是一类不超过22个核苷酸的小分子RNA，它们在基因表达调控中扮演着关键角色。尽管microRNA本身并不编码蛋白质，但它们通过与特定的信使RNA（mRNA）结合，精确地调控了基因表达的过程。在细胞内，microRNA会与特定的mRNA分子互补结合，通常是在mRNA的3’非编码区，这种结合会导致mRNA的降解或者翻译抑制，从而减少相应蛋白质的合成。北京大学基础医学院郭宇轩研究员团队通过在AAV9-Tnnt2转基因的3’UTR引入miR122的靶序列，大幅降低了AAV9-Tnnt2在肝脏组织中的表达泄露，提高了其心脏表达的特异性6。

 

注射方式、注射剂量和取材观察时间

目前常见的AAV导入心脏的方式有心肌注射、冠状动脉注射和静脉注射等，其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射和面部静脉注射等。各种导入方式的优缺点如下表（表4）

表4  AAV导入心脏的方式比较

视频参考链接如下：

1.小鼠心肌注射：https://app.jove.com/v/57074/a-simple-and-efficient-method-for-in-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation-by-intramyocardial-injection-in-mice

2.大鼠心肌注射：https://app.jove.com/v/2109/fabrication-of-biologically-derived-injectable-materials-for-myocardial-tissue-engineering

3.心脏基因治疗的方法和流程：https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-0716-2707-5

4.猪冠状动脉注射：https://app.jove.com/v/2778/gene-transfer-for-ischemic-heart-failure-in-a-preclinical-model

文献参考链接如下：

https://www.bilibili.com/video/BV1vk4y1J7AK/?spm_id_from=autoNext&vd_source=24ea8376fde6b21c732ad90cf33be710

各种注射方式和检测时间可以参考下表（表5）：

表5 不同物种的AAV注射方式和检测时间举例

 

派真生物始终致力于提供具有高效靶向性的腺相关病毒（AAV）载体，以满足基因治疗领域的精确递送需求。通过不断的创新和研发，派真生物自主研发的多种AAV新血清型提供了与AAV9相媲美的心肌靶向性解决方案， 欢迎后台留言或电话咨询试用。