AAV小知识 派真AAV生产 行业资讯 CRISPR+AAV AAV血清型 AAV常见问题

派真AAV生产

rAAV的复制需要有三个方面的元件:1. 辅助病毒如Adenovirus的多个辅助因子;2.AAV自身的复制蛋白Rep2及外壳蛋白CapX;3. 在两端带有能自退火形成"T"字形的回文重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的基因组。

 

01
三质粒共转染
 

派真生物主要运用三质粒共转染法进行AAV生产。把三个方面的元件分别放三个质粒中,再共转染含有腺病毒Adenovirus的E1a/b元件的HEK293细胞,细胞内组装成为rAAV。其优点是只需要构建含目的序列的rAAV质粒和进行普通的转染,快速、简便、病毒空壳率相对低,是目前使用最广泛的rAAV生产方式。缺点是由于是基于贴壁细胞基础上的生产,细胞扩大化生产会有较大困难。

02
稳定细胞株生产
 

建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因组的稳定细胞株,再用辅助病毒来感染生产出rAAV。优点是所用细胞可选能作悬浮培养的工业化生产细胞株,适合临床规模生产。缺点是稳定细胞株的建立与鉴定需要很长时间;细胞株需要注意多次传代后的稳定性;后续纯化过程中要注意完全失活辅助病毒。

03
病毒感染
 

用杆状病毒Baculovirus携带Rep/Cap基因及ITR基因组,去感染悬浮培养的SF9昆虫细胞,可以包装出rAAV。也有用重组单纯疱疹病毒1携带Rep/Cap基因及rAAV的基因组,感染悬浮培养的BHK乳仓鼠肾细胞来生产rAAV。优点是能规模化工业化扩大生产,适合临床级别rAAV生产。主要缺点是需要先生产携带Rep/Cap基因及rAAV的基因组的杆状病毒或重组单纯疱疹病毒(也有建立Rep/Cap的SF9稳定株,但同样需要rAAV基因组的杆状病毒),耗时长、影响因素复杂;早期的杆状病毒生产方法中的带有外源基因的杆状病毒基因组稳定性差,经过一定代数的生产后会缺失突变,目前新发展是问题得到较大改善;生产出来的rAAV感染能力较弱,目前有研究针对该问题做出了改进;后期纯化需要确保去除辅助病毒及病毒蛋白。

派真生物AAV的生产流程

AAV Production Process

生产流程