AAV小知识 派真AAV生产 行业资讯 CRISPR+AAV AAV血清型 AAV常见问题

AAV-CRISPR系统

2013年初,细菌中进化出来的免疫系统CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 被成功改造为编辑真核生物基因组的工具[ 1, 2,3 ],随后几年被广泛并深入应用于科学研究各个领域中。自从S.pyogenes Cas9(简称SpCas9)首次展示了对核酸的精准识别和切割能力以来,CRISPR系统越来越多的功能被发掘应用,如基因敲除、基因片段删除、基因抑制、基因激活、精确同源重组修复、精确点突变等。与AAV兼容性更好的短版本Cas9如SaCas9、NmCas9、AsCpf1和 LbCpf1等也被发现,它们的特性逐渐被阐明;而AAV则是目前为止对哺乳动物最安全、感染组织最为广泛的病毒类载体。至此,具有极强组织靶向可塑性的AAV与可行使多种功能CRSIPR系统的结合,已成为一个功能强大且潜在用途广泛的动物实验工具。

目前已发表以AAV为载体的CRISPR应用研究主要有基因敲除、基因片段删除、精确同源重组修复三类。 针对目前三个已有高水平研究结果发表的AAV-CRISPR应用,派真自行构建了最优化的“A/B/C/D/F/G/H” 六个系列入口载体,并且构建了尚未有相关研究发表的CRISPR激活的“E”入口载体,以方便科研人员获得高效的体内基因激活工具。

基因敲除

2013年三个独立实验室分别用实验证明在单个特异引导RNA的指导下[ 1, 2, 3 ],CRISPR-SpCas9能高效识别真核细胞基因组靶序列并进行切割,形成断裂的双链DNA。由于真核细胞存在非同源重组末端连接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ)的非精确修复机制,断裂的双链DNA再次被连接起来,从而获得少数碱基的删除或插入突变。利用这一特性,人们可以轻易获得靶标基因的突变。 这一技术的诞生对生命科学研究领域产生了革命性影响,在动物、植物、医学、微生物等多个领域都得到快速有效的应用,尤其在动物方面,基因组突变和动物模型的建立变得变得简单高效。

2014年,MIT的张锋实验室率先建立了SpCas9敲入小鼠[ 4 ],可在小鼠体内稳定表达或Cre依赖型地表达SpCas9。利用AAV携带sgRNA及供体修复序列来突变多个抑癌基因、精确修改KRAS基因成为高活性 KRAS致癌突变,在1至3个月内引起肿瘤发生。研究人员可从Jackson Lab购买SpCas9小鼠,也可以用AAV来传递SpCas9行使相似功能(可使用派真“A/B”系列入口载体)。

图1 引自CRISPR-Cas9 KnocK-In mice for genome editing and cancer modeling. Platt RJ et al.,Cell. 2014 Oct 9;159(2):440-55

2015年,MIT的张锋实验组发现了更短版本的SaCas9[ 5 ],并向野生型C57BL/6小鼠静脉注射了肝脏特异性表达的AAV8-SaCas9及表达靶向PCSK9的gRNA,3周后小鼠肝脏中的PCSK9 达到了近50%的敲除效率,血液中的PCSK9降低了90% (可使用派真“C/D” 系列入口载体)

图2 引自In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. F. Ann Ran et al. Nature 520, 186 (2015); doi:10.1038/nature14299

片段删除

2016年初,三个独立的实验室同时发表了治疗DMD(Duchenne 肌肉营养不良)小鼠的实验结果 [ 6,7,8 ]。他们都使用了相似的治疗策略:用AAV传递SaCas9或SpCas9及两个sgRNA以切除DMD小鼠模型DMD基因上的23号突变外显子,使跳过23号外显子的DMD基因读码框恢复正常。由于缺失23号外显子对功能影响不大,后DMD基因编码的Dystrophin功能得到部分恢复,小鼠的肌肉功能得到约40%的恢复,并且可能因为心肌功能的关键提升而延长DMD小鼠寿命至正常范围。

图3 引自In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.Mohammadsharif Tabebordbar et al.Science. 2016 Jan 22;351(6271):407-411

2016年5月,Temple大学的研究者使用AAV9转导SaCas9及sgRNA能够剔除或破坏HIV小鼠模型中HIV基因[ 9 ],在血液细胞、脑部、心脏、肾脏、肺、脾、肝脏达40%以上(可使用派真“C/D” 系列入入口载体)

图4 引自Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study.R Kaminski et al.Gene Ther. 2016 Aug;23(8-9):696

基因同源重组修复

前面已提及,2014年张锋实验室已使用AAV携带sgRNA及KRAS致癌突变的供体序列注射SpCas9小鼠,在小鼠体内成功获得精确同源重组突变,并且引发了预期的肿瘤 [ 4 ]。

图5 引自CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Platt RJ et al.,Cell. 2014 Oct 9;159(2):440-55

2016年5月,AAV研究领域的先锋James Wilson实验室发表了用AAV-CRISPR方法精确治疗OTC疾病小鼠的研究[ 10 ],他们使用双AAV策略,表达SaCas9及sgRNA、携带供体序列精确修复了OTC疾病小鼠体内肝细胞突变基因,修复率高达 6.7~20.1%。

图6 引自A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.Yang Yang et al.Nat Biotechnol. 2016 Mar;34(3):334-8. 图7 引自A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.Yang Yang et al.Nat Biotechnol. 2016 Mar;34(3):334-8.

基于以上最新进展,派真生物构建了“C / D”系列针对不同实验需求的SaCas9、SaCas9超低脱靶版本入口载体,以方便客户定制构建sgRNA载体。

基因激活

MIT的张锋实验室发现失去切割DNA活性后的突变体dCas9(Sp)仍然可以识别并结合DNA靶序列,如果dCas9与VP64转录激活蛋白 (来自单纯疱疹病毒 Herpes Simplex Viral Protein 16)融合,VP64就能激活结合位点下游的基因转录[ 11 ]。

图8 引自Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Konermann S et al. Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8.

另有研究人员发现14-15bp 的短sgRNA能使野生SpCas9结合到DNA靶序列处但不能切割靶序列,并且滞留在靶序列上不释放,这一效果与切割活性失活的dCas9相似[ 12 ];同时,带有额外的MS2环的sgRNA骨架能结合激活蛋白组分MS2-P65-HSF1,如果该靶序列位于某基因的上游,这些激活蛋白组分将聚集于该位置从而发挥激活基因转录的作用,最高能达1000倍以上基因激活表达量。

图9 引自Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease.James E Dahlman et al.Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61.

这两个现象及发展出来的技术已被阐明,但是尚未出现使用腺相关病毒AAV来达到激活目的基因的相关报道。因此,派真生物构建了“E”系列的SpCas9入口克隆载体,希望能满足科研工作者快速用上高效研究工具的需求,可以根据需要同时敲除和激活不同基因。